Co?IP 是體內(nèi)蛋白互作驗(yàn)證的經(jīng)典手段，分為內(nèi)源 Co?IP 與標(biāo)簽 Co?IP。輝駿生物結(jié)合大量項(xiàng)目實(shí)操經(jīng)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)諸多科研人員面臨以下相同困境：

①標(biāo)簽 Co?IP 結(jié)果缺少內(nèi)源驗(yàn)證，遭遇審稿人質(zhì)疑 

②內(nèi)源 Co?IP 易受抗體、蛋白豐度干擾，實(shí)驗(yàn)穩(wěn)定性不足 

③兩種體系數(shù)據(jù)相悖，難以支撐論文結(jié)論 

兩類實(shí)驗(yàn)體系各有特點(diǎn)，適用場景各不相同。輝駿生物從五大維度系統(tǒng)對比內(nèi)源 Co?IP 與標(biāo)簽 Co?IP，幫助研究者合理開展實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，規(guī)避科研路上常見難題。

1 內(nèi)源Co-IP與外源CO-IP實(shí)驗(yàn)原理

Co-IP：免疫共沉淀，顧名思義，就是利用抗體對抗原的特異性"免疫結(jié)合"，調(diào)取樣本中的目標(biāo)抗原（即目標(biāo)蛋白）及其結(jié)合蛋白。

這個(gè)技術(shù)捕獲的是樣本中已經(jīng)存在的蛋白復(fù)合體，所以我們要注意：

（1）要用溫和的裂解液（IP裂解液）裂解樣本，以保證細(xì)胞內(nèi)的蛋白復(fù)合體不會(huì)因操作而被打散；

（2）要用IP級別的抗體來調(diào)取目標(biāo)抗原。

根據(jù)目標(biāo)蛋白的不同來源，又可以分為：

• 內(nèi)源Co-IP：

用特異性高、親和力好的誘餌蛋白IP級別抗體（實(shí)驗(yàn)成敗的關(guān)鍵），來捕獲細(xì)胞內(nèi)天然表達(dá)的靶蛋白及其生理狀態(tài)下的互作蛋白。

它能最大程度保留蛋白互作的生理狀態(tài)，更貼合體內(nèi)真實(shí)互作場景，互作蛋白可信度高。

圖1 輝駿生物內(nèi)源Co-IP原理圖

• 外源Co-IP（通常為標(biāo)簽Co-IP）：

當(dāng)內(nèi)源蛋白表達(dá)量較低時(shí)，可以通過質(zhì)粒轉(zhuǎn)染來過表達(dá)誘餌蛋白，降低IP難度。

如果我們在過表達(dá)時(shí)讓蛋白帶上某個(gè)“標(biāo)簽”（例如Flag、HA、V5等），還能采用相應(yīng)的標(biāo)簽抗體磁珠來IP，這些抗體磁珠便宜又好用，同步解決了“IP級別抗體太貴或不好用”的問題，也省去了抗體與磁珠孵育的步驟。

但過表達(dá)的蛋白含量偏高于生理狀態(tài)，可能會(huì)存在假陽性互作，或更多的非特異性結(jié)合。

圖2 輝駿生物標(biāo)簽Co-IP原理圖

簡單來說，內(nèi)源CoIP依托天然內(nèi)源蛋白+特異性靶蛋白抗體，捕獲更天然狀態(tài)下的蛋白互作；標(biāo)簽CoIP依托標(biāo)簽融合蛋白過表達(dá)+標(biāo)簽抗體磁珠，更高效富集互作蛋白。具體區(qū)別如下：

2  內(nèi)源Co-IP與外源CO-IP主要應(yīng)用場景

• 內(nèi)源Co-IP

內(nèi)源性Co-IP一般用于驗(yàn)證性或者是發(fā)現(xiàn)性的研究。在天然環(huán)境下，篩選和發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性靶蛋白結(jié)合的已知/未知蛋白。

圖3 GSNOR蛋白的IP-MS鑒定示意圖-輝駿生物

• 標(biāo)簽Co-IP

與內(nèi)源CoIP一樣，外源性CoIP也可以篩選和發(fā)現(xiàn)已知/未知結(jié)合蛋白，此外，還可以通過構(gòu)建截短體、點(diǎn)突變等，找到蛋白互作的結(jié)構(gòu)域。

圖4 MYC蛋白截短體構(gòu)建示意圖-輝駿生物

3 內(nèi)源Co-IP與外源CO-IP實(shí)驗(yàn)核心步驟

• 內(nèi)源Co-IP

圖5 內(nèi)源Co-IP核心步驟-輝駿生物

• 標(biāo)簽Co-IP

圖6 標(biāo)簽Co-IP核心步驟-輝駿生物

輝駿生物IP專用二抗、Flag/HA/V5/GFP/RFP這5款類型的標(biāo)簽納米抗體磁珠，有效避免抗體輕重鏈污染，結(jié)合量高，親和力強(qiáng)。

4 內(nèi)源Co-IP VS 外源CO-IP周期和成本

• 內(nèi)源Co-IP

不需要構(gòu)建質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染，理論上總周期更短，但CoIP結(jié)果的好壞與IP抗體質(zhì)量和內(nèi)源蛋白的表達(dá)量息息相關(guān)，實(shí)驗(yàn)難度和不可控因素較多，實(shí)際的周期可能會(huì)更長。

需要購買誘餌蛋白的IP級別抗體，價(jià)格更高。

• 標(biāo)簽Co-IP

構(gòu)建載體和轉(zhuǎn)染會(huì)讓總周期增加，要提前評估實(shí)驗(yàn)難度，否則后續(xù)Co-IP可能無法開展。如果前期實(shí)驗(yàn)順利，CoIP難度更低，總周期更可控。

標(biāo)簽抗體磁珠的親和力好，價(jià)格低廉。

5 內(nèi)源Co-IP與外源CO-IP結(jié)果解讀

• 內(nèi)源Co-IP

Input：初始細(xì)胞裂解液，用來評估蛋白的表達(dá)情況和抗體效果，也可以作為WB實(shí)驗(yàn)的陽性對照。

IP對照組：用正常IgG做IP，由于IgG本身不結(jié)合任何蛋白，如果有條帶，說明存在非特異性結(jié)合，結(jié)果不可信。

IP實(shí)驗(yàn)組：用CXCR3抗體（目標(biāo)誘餌蛋白抗體）做IP，再分別用CXCR3抗體和Beclin1抗體（待測蛋白）做WB檢測。CXCR3抗體檢測有條帶，說明IP成功；Beclin1抗體檢測有條帶，說明CXCR3與Beclin1有相互作用。

圖7 內(nèi)源Co-IP結(jié)果解讀-輝駿生物

• 標(biāo)簽Co-IP

Input：與內(nèi)源Co-IP Input作用是一樣的，這里可以看質(zhì)粒是否轉(zhuǎn)染成功。轉(zhuǎn)染某個(gè)質(zhì)粒后顯示有條帶，說明蛋白表達(dá)成功。

IP對照組：共轉(zhuǎn)HA空載體質(zhì)粒+Flag-MVP質(zhì)粒。

IP實(shí)驗(yàn)組：共轉(zhuǎn)HA-ASK1質(zhì)粒+Flag-MVP質(zhì)粒，用HA抗體進(jìn)行IP，再分別用HA抗體和Flag抗體（待測蛋白）做WB檢測。HA抗體檢測有條帶，說明IP成功；Flag抗體檢測有條帶，說明HA-ASK1與Flag-MVP存在相互作用。

圖8 標(biāo)簽Co-IP結(jié)果解讀-輝駿生物

輝駿生物總結(jié)：內(nèi)源性Co-IP & 外源性Co-IP在哪種情況下適用：

?如果想要驗(yàn)證兩個(gè)蛋白的相互作用，兩種方法均可，很多文章會(huì)同時(shí)使用兩種方法驗(yàn)證。如果條件不允許而只能選其一，在易于構(gòu)建載體和轉(zhuǎn)染的基礎(chǔ)上，優(yōu)選外源Co-IP，操作簡單，成功率高。

?如果想要尋找未知蛋白的互作蛋白，兩種方法均可，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)難度、抗體效果、周期和成本等綜合考慮。

?如果想要證明互作在某種疾病或者生理狀態(tài)下發(fā)生，需要用特定組織樣本做，則選內(nèi)源Co-IP。

?如果想要研究互作的具體區(qū)域或關(guān)鍵位點(diǎn)，用外源Co-IP，方便構(gòu)建各種突變體或截短體。

值得注意：內(nèi)源 Co?IP 與標(biāo)簽 Co?IP 僅能夠證實(shí)胞內(nèi)蛋白存在相互作用，無法區(qū)分直接結(jié)合與間接結(jié)合。若需驗(yàn)證蛋白直接互作，可采用 GST pull down 開展體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)。

需獲取 Co-IP 完整 protocol、蛋白互作外包實(shí)驗(yàn)需求，可咨詢輝駿生物：4006991663，一站式解決內(nèi)源 CoIP、標(biāo)簽 CoIP、Pull down 等實(shí)驗(yàn)需求。