免疫沉淀（IP）、免疫共沉淀（Co-IP）及GST pull-down、RNA pull-down、DNA pull-down、藥物pull-down等各類實驗，是解析蛋白互作關(guān)系、挖掘分子機(jī)制的核心技術(shù)手段，而質(zhì)譜鑒定作為此類實驗的關(guān)鍵收尾環(huán)節(jié)，其儀器性能與檢測模式的科學(xué)選擇，直接決定互作蛋白鑒定的深度、靈敏度及結(jié)果可靠性，更是規(guī)避“蛋白富集成功但有效鑒定率偏低”“背景雜蛋白干擾”“數(shù)據(jù)重復(fù)性差”等科研痛點的核心關(guān)鍵。

輝駿生物深耕蛋白互作與蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域15年，依托完善的質(zhì)譜檢測平臺與深厚的技術(shù)積淀，針對CoIP-MS實驗中質(zhì)譜儀和檢測方法的選擇這一問題，以同一IP富集樣本為研究對象，系統(tǒng)對比Orbitrap Fusion Lumos與Orbitrap Astral兩大主流高分辨質(zhì)譜儀的檢測表現(xiàn)，從蛋白鑒定數(shù)目、背景污染控制效率、互作蛋白數(shù)據(jù)質(zhì)量（含肽段匹配度、蛋白定量準(zhǔn)確性）等核心維度展開系統(tǒng)分析，為科研同行開展IP-MS相關(guān)實驗、科學(xué)選擇適配儀器及檢測模式提供嚴(yán)謹(jǐn)、可落地的技術(shù)參考，助力科研工作者高效推進(jìn)課題研究、突破技術(shù)瓶頸。

常用質(zhì)譜儀簡介

1、Orbitrap Fusion Lumos質(zhì)譜儀

從儀器核心構(gòu)造與性能優(yōu)勢來看，Orbitrap Fusion Lumos質(zhì)譜儀整合了“高選擇性四極桿+雙壓線性離子阱（LIT）+經(jīng)典Orbitrap”三重質(zhì)量分析器，其核心技術(shù)優(yōu)勢集中體現(xiàn)在離子破碎與信號放大能力上。該儀器依靠離子阱實現(xiàn)層層遞進(jìn)的離子破碎過程，支持原生CID、HCD及可選ETD/EThcD/UVPD等多種碎裂模式，具備超強(qiáng)的MS?多級質(zhì)譜解析能力；同時可通過長時間離子累積，將微量蛋白信號有效放大，這一特性使其在低豐度互作蛋白鑒定、蛋白修飾位點解析、復(fù)雜蛋白結(jié)構(gòu)鑒定及蛋白從頭測序等場景中展現(xiàn)出顯著優(yōu)勢，尤其適配IP-MS實驗中互作蛋白豐度差異大、樣本復(fù)雜度高的核心需求。

在檢測模式方面，Orbitrap Fusion Lumos可靈活切換DDA（數(shù)據(jù)依賴性采集）與DIA（數(shù)據(jù)非依賴性采集）兩種主流模式，適配不同IP-MS實驗的檢測需求。其中，DDA模式屬于靶向性采集方式，其核心原理是在質(zhì)譜全掃描過程中，優(yōu)先篩選信號強(qiáng)度較高的母離子，對其進(jìn)行逐級碎裂并開展二級質(zhì)譜采集，可精準(zhǔn)聚焦高豐度互作蛋白及其肽段；DIA模式則屬于無靶向采集方式，通過將質(zhì)譜全掃描范圍劃分為若干子窗口，對每個窗口內(nèi)的所有離子進(jìn)行循環(huán)碎裂與全面檢測，該模式具備超高分辨率（最高可達(dá)500,000）、亞飛克級檢測限的超高靈敏度及快速掃描特性，能夠最大程度捕獲樣本中低豐度互作蛋白信息，有效提升IP-MS實驗中互作蛋白的鑒定覆蓋率與可靠性。

圖1 Orbitrap Fusion Lumos質(zhì)譜儀

2、Orbitrap Astral質(zhì)譜儀

Orbitrap Astral質(zhì)譜儀結(jié)合了“高選擇性四極桿+經(jīng)典Orbitrap+快速Astral”三重質(zhì)量分析器，與Orbitrap Fusion Lumos相比，它去掉了線性離子阱，犧牲了結(jié)構(gòu)深度（僅HCD為主，不支持CID、原生無ETD離子阱碎裂模式 ），但新增了Astral高速無損檢測器，雙路并行采集，換來了更快的掃描速度和高通量DIA，一天可以檢測上百個樣本，特別適合于大規(guī)模高通量DIA蛋白組學(xué)檢測，縮短上機(jī)時間。

Orbitrap Astral質(zhì)譜儀也有DDA和DIA兩種采集模式，但主要選擇DIA模式（數(shù)據(jù)非依賴性采集）進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)檢測。

圖2 Orbitrap Astral質(zhì)譜儀

3、Orbitrap Fusion Lumos與Orbitrap Astral質(zhì)譜儀的區(qū)別

Orbitrap Fusion Lumos、Orbitrap Astral做IP蛋白樣本鑒定的數(shù)據(jù)質(zhì)量到底如何？下面輝駿生物分別用這兩大質(zhì)譜儀對IP樣本進(jìn)行測試，以對Orbitrap Fusion Lumos、Orbitrap Astral數(shù)據(jù)質(zhì)量有一個客觀認(rèn)知。

實驗技術(shù)路線及方案

1、CoIP MS技術(shù)路線

圖3 IP-MS技術(shù)路線圖

2、檢測方案

為了公平對比兩款儀器的真實性能，輝駿生物設(shè)置了嚴(yán)格的對照體系：

? 本次實驗包含：IP control（陰性對照）、IP sample（實驗樣本）；將IP獲得的蛋白溶液進(jìn)行酶解，并將肽段樣本一分為二，分別用不同的質(zhì)譜儀檢測；

? 兩組樣本前后各插入1針H?O空白樣本，通過水樣本的蛋白檢出量評估儀器背景污染；

? 兩種質(zhì)譜儀均采用DIA（數(shù)據(jù)非依賴采集）方法，產(chǎn)生的數(shù)據(jù)均用DIA-NN軟件檢索；

? 誘餌蛋白為PSMD14，全面評估誘餌蛋白的檢出穩(wěn)定性、背景污染、互作蛋白鑒定三大核心指標(biāo)。

實驗數(shù)據(jù)鑒定結(jié)果

1、誘餌蛋白PSMD14檢出效果

誘餌蛋白的穩(wěn)定檢出是IP質(zhì)譜實驗的前提，且空白或空載對照組中不能出現(xiàn)誘餌蛋白污染：

? Fusion Lumos：僅在IP sample中檢出PSMD14蛋白，control、H?O-1、H?O-2組均無檢出，無交叉污染，誘餌信號100%可靠；

? Orbitrap Astral：除IP sample外，H?O-2空白樣本中也檢出了PSMD14，說明存在儀器殘留污染。

結(jié)論：在誘餌蛋白檢出穩(wěn)定性方面，兩種質(zhì)譜儀都可以穩(wěn)定檢測到誘餌蛋白，但Astral對照組有誘餌蛋白污染。

2、蛋白鑒定數(shù)目和背景污染

輝駿生物通過水空白樣本的蛋白鑒定數(shù)直觀評估：

? Fusion Lumos：H?O-1僅檢出139個蛋白，H?O-2也僅檢出97個蛋白，背景污染少，不易因儀器殘留帶來假陽性干擾；

? Orbitrap Astral：H?O-1檢出1183個蛋白，H?O-2仍有840個蛋白，背景噪音高，大量儀器殘留蛋白會干擾真實互作的篩選。

結(jié)論：在蛋白鑒定總數(shù)方面，Astral更多；在背景污染方面，F(xiàn)usion Lumos更干凈。

3、互作蛋白鑒定能力

輝駿生物通過“樣本扣除對照”的方式，篩選潛在的特異性互作蛋白：

? Fusion Lumos：sample扣除control后，得到332個共有蛋白（污染蛋白）、1019個差異蛋白（潛在互作蛋白）；

? Orbitrap Astral：sample扣除control后，得到799個共有蛋白（污染蛋白）、910個差異蛋白（潛在互作蛋白）；

Fusion Lumos背景污染少，因此鑒定到了更多的潛在互作蛋白，低豐度互作蛋白的捕獲能力強(qiáng)。

結(jié)合現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫資源，查詢已收錄的PSMD14蛋白的已知互作蛋白（共523個），評估本次IP樣本使用不同質(zhì)譜儀的互作蛋白鑒定質(zhì)量：

結(jié)論：在互作蛋白鑒定能力方面，F(xiàn)usion Lumos鑒定到的互作蛋白更多，可信比例更高，數(shù)量與質(zhì)量雙優(yōu)。

實驗數(shù)據(jù)分析說明

1、背景污染控制

Fusion Lumos 優(yōu)于 Orbitrap Astral

2、鑒定蛋白總數(shù)

Orbitrap Astral 優(yōu)于 Fusion Lumos

3、互作蛋白數(shù)量和質(zhì)量

Fusion Lumos 優(yōu)于 Orbitrap Astral

4、優(yōu)缺點總結(jié)

?Fusion Lumos：誘餌蛋白檢出穩(wěn)定，背景污染少，鑒定到的互作蛋白數(shù)量多，綜合表現(xiàn)優(yōu)異，是IP或pull-down樣本互作蛋白鑒定的理想機(jī)型；因檢出的候選蛋白較多，后期可以搭配生信分析來減少篩選難度。

?Orbitrap Astral：檢測靈敏度高，所以蛋白鑒定數(shù)量最多，但背景污染較重，如果做IP樣本，假陽性率偏高，且必須留意上機(jī)順序，否則對照組易出現(xiàn)誘餌蛋白。

綜上，Fusion Lumos儀器在IP類樣本的質(zhì)譜鑒定方面的表現(xiàn)更為出色，能平衡鑒定蛋白數(shù)量和背景污染的問題，得到更多高質(zhì)量的互作蛋白。

服務(wù)全新升級

依托自身在蛋白互作與蛋白質(zhì)組學(xué)領(lǐng)域的長期深耕與技術(shù)積淀，輝駿生物搭建了涵蓋Orbitrap Fusion Lumos、Orbitrap Astral等多種主流質(zhì)譜儀的專業(yè)檢測平臺，形成了從IP/pull-down樣本富集到質(zhì)譜鑒定的全流程一站式實驗服務(wù)體系。該服務(wù)不僅為客戶提供標(biāo)準(zhǔn)化、高效化的實驗操作支持，更配套專業(yè)技術(shù)指導(dǎo)，全程助力客戶解決實驗過程中的技術(shù)難點，打造了IP/pull-down樣本質(zhì)譜鑒定領(lǐng)域的標(biāo)桿級服務(wù)范式。憑借完善的平臺配置與深厚的技術(shù)積累，輝駿生物持續(xù)為科研工作者賦能，助力其在分子機(jī)制探索、疾病靶點挖掘等相關(guān)研究中突破技術(shù)瓶頸，取得更多高質(zhì)量科研成果。

LC-MS/MS蛋白質(zhì)譜鑒定 * 服務(wù)信息

LC-MS/MS蛋白質(zhì)譜鑒定 * 輝駿生物服務(wù)優(yōu)勢

輝駿生物旨在為客戶提供良好的蛋白質(zhì)譜鑒定服務(wù)，客戶可以進(jìn)行幾乎所有感興趣的研究，如蛋白質(zhì)組分析、小分子的高分辨率分析、復(fù)雜環(huán)境中小分子的定量分析等。

輝駿生物蛋白質(zhì)譜鑒定LC-MS/MS客戶文章（1區(qū)，IF>20）

以上即為本期內(nèi)容的核心分享，對于有IP-MS蛋白質(zhì)譜鑒定、蛋白修飾鑒定需求的科研工作者，可隨時聯(lián)系輝駿生物。輝駿生物不僅提供多元化核心產(chǎn)品，涵蓋Flag、HA、V5、GFP、RFP等各類納米抗體磁珠，IP專用VHH抗鼠二抗、標(biāo)簽抗體、內(nèi)參抗體，以及各類蛋白互作試劑盒；同時還提供全方位實驗與檢測服務(wù)，包括RIP、RNA pull down、ChIP、DNA pull down、Co-IP等蛋白互作實驗服務(wù)，以及IP樣本蛋白鑒定、蛋白修飾鑒定、蛋白組學(xué)等蛋白檢測服務(wù)。若有相關(guān)技術(shù)咨詢或產(chǎn)品訂購需求，歡迎隨時與我們溝通。

輝駿生物簡介

廣州輝駿生物科技股份有限公司（Fitgene）成立于2011年，超15年科研服務(wù)經(jīng)驗，專業(yè)提供蛋白（抗體）和互作實驗服務(wù)，包括蛋白質(zhì)譜檢測、蛋白/RNA/DNA/化合物等分子間相互作用檢測、抗體穩(wěn)定表達(dá)株構(gòu)建、基因敲除和過表達(dá)細(xì)胞株構(gòu)建等；同時還研發(fā)了納米抗體磁珠、IP專用二抗、互作試劑盒、標(biāo)簽抗體等科研產(chǎn)品。

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