轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合啟動子位點(diǎn)預(yù)測及互作驗(yàn)證完整步驟

基因表達(dá)調(diào)控是各類生命活動的核心基礎(chǔ)，轉(zhuǎn)錄因子（TF）是關(guān)鍵調(diào)控蛋白。其可特異性結(jié)合基因啟動子、增強(qiáng)子等DNA元件，調(diào)控基因轉(zhuǎn)錄與表達(dá)強(qiáng)度，構(gòu)建基因調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，是基因功能與分子機(jī)制研究的核心靶點(diǎn)。

完成目標(biāo)DNA片段（多為基因啟動子）功能驗(yàn)證后，篩選鑒定其結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子，是解析DNA調(diào)控機(jī)制、闡明基因上游通路的核心關(guān)鍵步驟?？蒲袑?shí)驗(yàn)中，常因候選因子篩選混亂、非特異性結(jié)合無法去除、實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)不規(guī)范等問題，導(dǎo)致數(shù)據(jù)重復(fù)性差、難以滿足SCI發(fā)表要求。

目前SCI通用的轉(zhuǎn)錄因子篩選體系，遵循初篩候選—精準(zhǔn)驗(yàn)證—鎖定靶點(diǎn)的標(biāo)準(zhǔn)化流程：通過數(shù)據(jù)庫預(yù)測、DNA pull-down MS體外高通量篩選候選轉(zhuǎn)錄因子，再結(jié)合ChIP-qPCR體內(nèi)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證DNA-蛋白特異性互作，剔除假陽性蛋白，精準(zhǔn)鎖定靶向結(jié)合的轉(zhuǎn)錄因子。

輝駿生物結(jié)合高分SCI文獻(xiàn)，詳解轉(zhuǎn)錄因子篩選、鑒定、驗(yàn)證全套方法，拆解DNA pull-down、ChIP核心實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)思路、操作要點(diǎn)與結(jié)果分析邏輯，總結(jié)實(shí)驗(yàn)誤區(qū)與優(yōu)化方案，助力科研人員快速完成標(biāo)準(zhǔn)化實(shí)驗(yàn)、產(chǎn)出可發(fā)表數(shù)據(jù)；專業(yè)技術(shù)團(tuán)隊(duì)提供一對一答疑服務(wù)！

目標(biāo)DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子研究思路

目標(biāo)DNA結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子篩選思路遵循“篩選-驗(yàn)證-確證”的完整研究體系：

第一步，通過DNA pull-down MS實(shí)驗(yàn)和數(shù)據(jù)庫檢索分析，篩選出可能與目標(biāo)啟動子DNA結(jié)合的候選轉(zhuǎn)錄因子，完成“篩選”環(huán)節(jié)；

第二步，通過Jaspar等數(shù)據(jù)庫預(yù)測目標(biāo)啟動子與待測轉(zhuǎn)錄因子的潛在結(jié)合位點(diǎn)；

第三步，采用ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)，捕獲轉(zhuǎn)錄因子與目標(biāo)DNA的復(fù)合物，排除非特異性結(jié)合蛋白，落實(shí)“驗(yàn)證”環(huán)節(jié)；

第四步，明確轉(zhuǎn)錄因子對目標(biāo)DNA的特異性結(jié)合和調(diào)控作用，完成“功能確證”環(huán)節(jié)，形成完整的DNA-轉(zhuǎn)錄因子互作研究閉環(huán)。

轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測及結(jié)合位點(diǎn)驗(yàn)證應(yīng)用案例

案例1：TRIM34的轉(zhuǎn)錄因子是YY1

圖1 引自Yao F, Zhou S, Zhang R, et al. CRISPR/Cas9 screen reveals that targeting TRIM34 enhances ferroptosis sensitivity and augments immunotherapy efficacy in hepatocellular carcinoma. Cancer Lett 593:216935(2024).

（1）轉(zhuǎn)錄因子篩選：在PROMO、hTF target、Human TFDB和GTRD數(shù)據(jù)庫中搜索可能激活TRIM34轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄因子，確定四個(gè)候選因子：YY1、TBP、AR和POU2F1（圖1A）。

（2）qRT-PCR和WB實(shí)驗(yàn)：表明YY1敲低顯著降低HCC細(xì)胞中TRIM34的表達(dá)，YY1成為可能調(diào)控TRIM34的轉(zhuǎn)錄因子（圖1B和C）。

（3）TCGA數(shù)據(jù)分析YY1與TRIM34表達(dá)相關(guān)性：結(jié)果顯示YY1和TRIM34的mRNA水平呈正相關(guān)（圖1D），并在HCC組織樣本中得到進(jìn)一步驗(yàn)證（圖1E）。

（4）Jaspar數(shù)據(jù)庫預(yù)測：顯示TRIM34啟動子中潛在的YY1結(jié)合位點(diǎn)（YBS），發(fā)現(xiàn)該基因組片段中存在兩個(gè)預(yù)測的YBS（圖1G）。

（5）ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)：證實(shí)YY1與TRIM34啟動子區(qū)域存在相互作用（圖1F）。

（6）雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)：結(jié)果表明YBS1突變消除了YY1上調(diào)TRIM34轉(zhuǎn)錄的能力，證實(shí)YY1通過與TRIM34啟動子相互作用刺激TRIM34轉(zhuǎn)錄，進(jìn)而導(dǎo)致HCC中TRIM34過表達(dá)（圖1H）。

案例2：SHANK3的轉(zhuǎn)錄因子是YBX1

（1）探針設(shè)計(jì)：設(shè)計(jì)三個(gè)潛在轉(zhuǎn)錄因子探針，用于DNA pull-down實(shí)驗(yàn)（圖2a）。

（2）DNA pull-down MS（由輝駿生物提供技術(shù)服務(wù)）篩選轉(zhuǎn)錄因子：對DNA pull-down復(fù)合體進(jìn)行質(zhì)譜檢測，將實(shí)驗(yàn)組數(shù)據(jù)扣除對照組數(shù)據(jù)，得到目標(biāo)DNA的結(jié)合蛋白列表，通過生信分析篩選其中的轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子YBX1位于排序表的首位（圖2b和2c）。

（3）ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)：證實(shí)YBX1與SHANK3啟動子的HyperM區(qū)域存在相互作用（圖2d）。

（4）用shRNA敲低轉(zhuǎn)錄因子YBX1的表達(dá)后，SHANK3的水平也下降了，表明YBX1能結(jié)合SHANK3啟動子并下調(diào)其表達(dá)。

圖2 引自[輝駿生物客戶文章] Ni P, Zhou C, Liang S, et al. YBX1-Mediated DNA Methylation-Dependent SHANK3 Expression in PBMCs and Developing Cortical Interneurons in Schizophrenia. Adv Sci (Weinh) 10(20):e2300455(2023).

案例3：PD-L1的轉(zhuǎn)錄因子是EED

（1）DNA pull-down MS和數(shù)據(jù)分析：篩選到PD-L1啟動子的潛在結(jié)合蛋白（DEPs）共34個(gè)，通過hTF-target數(shù)據(jù)庫交叉分析，從中確定了一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子EED進(jìn)行后續(xù)研究（圖3a，由輝駿生物提供技術(shù)服務(wù)）。

（2）功能實(shí)驗(yàn)：發(fā)現(xiàn)CXCL1可顯著誘導(dǎo)EED的表達(dá)和入核，促進(jìn)PD-L1啟動子活性和蛋白表達(dá)（圖3b-d）；而敲低EED可部分消除CXCL1誘導(dǎo)的PD-L1轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)（圖3c，d）。

（3）JASPAR數(shù)據(jù)庫預(yù)測轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)：結(jié)果顯示PD-L1啟動子區(qū)域存在一個(gè)潛在的EED結(jié)合位點(diǎn)（5'-GTTCCACTC-3'，?437 ~?429bp）（圖3e）。

（4）ChIP-qPCR實(shí)驗(yàn)：證實(shí)EED與PD-L1啟動子存在相互作用，且CXCL1可顯著促進(jìn)EED與PD-L1啟動子的結(jié)合；而敲低EED可部分消除二者間的相互作用（圖3e）。

（5）啟動子結(jié)合區(qū)域突變實(shí)驗(yàn)：表明EED與PD-L1啟動子的結(jié)合區(qū)域發(fā)生反義突變后，可顯著消除CXCL1對PD-L1啟動子活性的的誘導(dǎo)作用（圖3f）。

圖3 引自[輝駿生物客戶文章] Wang S, Li J, Hong S, et al. Chemotherapy-elicited extracellular vesicle CXCL1 from dying cells promotes triple-negative breast cancer metastasis by activating TAM/PD-L1 signaling. J Exp Clin Cancer Res 43(1):121(2024).

DNA pull down和ChIP技術(shù)簡介

DNA pull down實(shí)驗(yàn)

DNA pull down是研究目標(biāo)DNA序列與蛋白質(zhì)相互作用的技術(shù)。通過在體外條件下制備生物素標(biāo)記的目標(biāo)DNA探針，來調(diào)取樣本中與之結(jié)合的蛋白質(zhì)，可以用來篩選未知結(jié)合蛋白，或驗(yàn)證預(yù)測的已知蛋白。

圖4 DNA pull-dwon實(shí)驗(yàn)技術(shù)流程圖

ChIP實(shí)驗(yàn)
ChIP是研究目標(biāo)蛋白質(zhì)與DNA相互作用的技術(shù)。利用誘餌蛋白抗體來調(diào)取生物體內(nèi)天然結(jié)合的誘餌蛋白及其結(jié)合DNA片段的復(fù)合體，進(jìn)而通過測序?qū)ふ椅粗慕Y(jié)合DNA序列，或通過qPCR驗(yàn)證預(yù)測的已知DNA序列。

圖5 ChIP實(shí)驗(yàn)技術(shù)流程圖

DNA pull-down和ChIP實(shí)驗(yàn)常見問題

1、DNA探針標(biāo)記用脫硫生物素還是不脫硫生物素？

脫硫生物素標(biāo)記的DNA探針結(jié)合力強(qiáng)一點(diǎn)，但不易洗脫；不脫硫生物素標(biāo)記的探針結(jié)合稍差一點(diǎn)，但容易洗脫。兩者都可以用，但考慮到最終都要洗脫下來做實(shí)驗(yàn)，而不脫硫的探針簡單且成本低，所以應(yīng)用更廣泛。

2、DNA pull-down實(shí)驗(yàn)是否一定要提核蛋白做？

DNA pull-down實(shí)驗(yàn)是否一定要提核蛋白做？最好提取核蛋白，但如果碰到動植物組織等樣本核蛋白提取比較難或提取效率低的情況，可以直接提總蛋白做。因?yàn)楦哽`敏度的質(zhì)譜儀可以保證低豐度的核蛋白不漏檢，而生信分析也可以幫助尋找數(shù)據(jù)中的核蛋白和轉(zhuǎn)錄因子。

* 輝駿生物深耕蛋白檢測10多年，可以提供高效的質(zhì)譜檢測服務(wù)。

3、ChIP關(guān)于抗體有何要求？如何選擇？

ChIP實(shí)驗(yàn)中的抗體對于特異性、親和力、效價(jià)都具有較高要求，能夠成功用于WB、IHC等實(shí)驗(yàn)的抗體并不確保能成功運(yùn)用于ChIP，因此需要選用經(jīng)過ChIP驗(yàn)證的商品化抗體，這類抗體常會標(biāo)明ChIP grade。

關(guān)于單抗和多抗。單抗具有特異性優(yōu)勢，但風(fēng)險(xiǎn)在于其識別表位可能恰好被掩蔽（DNA或交聯(lián)環(huán)節(jié)），而多抗可識別多個(gè)表位可基本避免該風(fēng)險(xiǎn)。因此單多抗各有優(yōu)缺點(diǎn)，應(yīng)重點(diǎn)關(guān)注該抗體是否經(jīng)過ChIP驗(yàn)證。

4、所研究的蛋白難以找到ChIP級抗體怎么辦？

較常用的方式可以將目的蛋白同某種標(biāo)簽融合表達(dá)，比如HA、GFP、Flag等標(biāo)簽，使用這些標(biāo)簽抗體的ChIP級抗體，這種途徑也常見于發(fā)表文獻(xiàn)中。

輝駿生物現(xiàn)有 Flag/HA/GFP/RFP 4款類型的標(biāo)簽ChIP試劑盒，有需要的小伙伴可以聯(lián)系！

5、染色質(zhì)片段大小在哪個(gè)范圍比較合適？

對于ChIP-seq，打斷后的DNA電泳主帶在200~500bp范圍內(nèi)，主峰在200~300bp是最合適范圍；對于ChIP-qPCR，打斷后的DNA片段在300~1000bp左右適宜。

6、ChIP實(shí)驗(yàn)如何設(shè)置對照及重復(fù)？

通常ChIP過程產(chǎn)生3份DNA產(chǎn)物，Input、IgG產(chǎn)物、IP產(chǎn)物。Input是染色質(zhì)片段化后提取獲得的總DNA、未經(jīng)抗體加入免疫沉淀過程，IgG組這是用實(shí)驗(yàn)抗體的同型陰性對照抗體（作為mock IP），IP產(chǎn)物即是以實(shí)驗(yàn)抗體獲得的免疫沉淀產(chǎn)物。

在后續(xù)的qPCR檢測中，通常將IgG產(chǎn)物組作為IP產(chǎn)物組的對照。如需設(shè)置陽性對照抗體，可以選擇Histone H3或者RNA polymerase II，然后以GAPDH或Actin等作為檢測基因。

在后續(xù)的Sequence中，通常將Input組產(chǎn)物作為測序?qū)φ諛悠贰?/span>

輝駿生物DNA pull-down和ChIP試劑盒

輝駿生物實(shí)驗(yàn)服務(wù)優(yōu)勢

輝駿生物擁有十余年分子互作實(shí)驗(yàn)技術(shù)積淀，專注為DNA-蛋白、蛋白-蛋白、RNA-蛋白互作課題提供一站式全流程解決方案。可提供DNA pull-down、ChIP實(shí)驗(yàn)技術(shù)服務(wù)與配套試劑產(chǎn)品。從實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)、實(shí)操檢測到文章發(fā)表提供全程技術(shù)支撐，累計(jì)協(xié)助客戶發(fā)表百余篇國際高水平SCI期刊成果。