在蛋白互作研究中，精準(zhǔn)篩選、驗(yàn)證目標(biāo)蛋白的互作分子，是實(shí)驗(yàn)的核心重點(diǎn)，也是科研推進(jìn)的主要難點(diǎn)。目前主流的蛋白互作研究體系遵循“高通量初篩—多層實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證—鎖定關(guān)鍵位點(diǎn)”的核心邏輯：首先借助IP-MS、Pull-down MS高通量技術(shù)，批量挖掘目標(biāo)蛋白的候選互作分子；再通過CoIP、GST pulldown等經(jīng)典實(shí)驗(yàn)分層驗(yàn)證，剔除假陽性結(jié)果，確認(rèn)真實(shí)互作靶蛋白；可結(jié)合免疫熒光（IF）觀測蛋白胞內(nèi)共定位，進(jìn)一步佐證互作真實(shí)性；最后通過構(gòu)建蛋白截短突變體、點(diǎn)突變體，精準(zhǔn)定位蛋白互作的核心關(guān)鍵區(qū)域。

輝駿生物結(jié)合多篇SCI經(jīng)典文獻(xiàn)，系統(tǒng)拆解IP-MS、Co-IP、GST Pull-down核心實(shí)驗(yàn)的設(shè)計(jì)思路與結(jié)果分析邏輯，手把手梳理蛋白互作篩選與驗(yàn)證完整流程，助力科研人員高效攻克實(shí)驗(yàn)難點(diǎn)、推進(jìn)課題研究。如有相關(guān)實(shí)驗(yàn)技術(shù)疑問或?qū)嶒?yàn)服務(wù)需求，可隨時(shí)咨詢輝駿生物！

蛋白與蛋白互作研究思路

第一步，通過IP-MS實(shí)驗(yàn)，篩選出目標(biāo)蛋白富集度最高的候選互作蛋白，完成“篩選”環(huán)節(jié)；

第二步，采用Co-IP、GST pull-down實(shí)驗(yàn)，對篩選出的候選蛋白與目標(biāo)蛋白的互作關(guān)系進(jìn)行驗(yàn)證，落實(shí)“驗(yàn)證”環(huán)節(jié)；

第三步，構(gòu)建目標(biāo)蛋白與互作蛋白的互作結(jié)構(gòu)域，為“確證”互作核心位點(diǎn)奠定基礎(chǔ)；

第四步，通過分段Co-IP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證互作結(jié)構(gòu)域，明確互作核心區(qū)域，完成“確證”環(huán)節(jié)，形成完整的蛋白-蛋白互作研究閉環(huán)。

IP-MS篩選互作蛋白應(yīng)用案例

1、IP-MS篩選GSNOR的互作蛋白是NEDD4

第一步，IP-MS篩選GSNOR的互作蛋白

通過 anti-GSNOR IP-MS 技術(shù)鑒定 GSNOR 的相互作用蛋白，并結(jié)合數(shù)據(jù)庫預(yù)測發(fā)現(xiàn)GSNOR的核心候選互作蛋白為NEDD4（圖1A）。

第二步，驗(yàn)證GSNOR與NEDD4的相互作用

GST pull-down實(shí)驗(yàn)證實(shí)GSNOR與NEDD4存在直接相互作用（圖1B）。

Co-IP實(shí)驗(yàn)在組織和細(xì)胞層面上進(jìn)一步證實(shí)GSNOR與NEDD4存在相互作用（圖1C、1D）。

圖1 引自Tang X, Liu X, Sha X, et al. NEDD4-Mediated GSNOR Degradation Aggravates Cardiac Hypertrophy and Dysfunction. Circ Res 136(4):422-438(2025).

2、IP-MS篩選GCLM的互作蛋白是NKRF

第一步，IP-MS篩選GCLM的互作蛋白

通過anti-Flag-GCLM IP-MS（由輝駿生物提供技術(shù)）鑒定與GCLM相互作用的蛋白，分析顯示GCLM與NKRF存在關(guān)聯(lián)（圖2a）。

第二步，驗(yàn)證GCLM與NKRF相互作用

CoIP實(shí)驗(yàn)表明GCLM和NKRF相互作用（圖2b）。

GST pulldown實(shí)驗(yàn)也證實(shí)GCLM與NKRF互作（圖2c）。

Co-IP、熒光共定位證明GCLM主要與細(xì)胞核中的NKRF相互作用（圖2e、2f）。

圖2 引自[輝駿生物客戶文章] Lin JF, Liu ZX, Chen DL, et al. Nucleus-translocated GCLM promotes chemoresistance in colorectal cancer through a moonlighting function. Nat Commun 16(1):263(2025).  

3、IP-MS篩選STAMBPL1的互作蛋白是NRF2

第一步，IP-MS篩選STAMBPL1的互作蛋白

通過anti-STAMBPL1 IP-MS技術(shù)鑒定與STAMBPL1相互作用的蛋白（圖3a），分析顯示NRF2是STAMBPL1關(guān)鍵候選互作蛋白（圖3b-c）。

第二步，驗(yàn)證STAMBPL1與NRF2相互作用

正反拉CoIP實(shí)驗(yàn)證實(shí)STAMBPL1與NRF2存在內(nèi)源性相互作用（圖3d-e）。

GST pull down實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)STAMBPL1與NRF2存在直接相互作用（圖3f）。

免疫熒光共定位實(shí)驗(yàn)證明STAMBPL1與NRF2在RBE細(xì)胞的胞質(zhì)及細(xì)胞核內(nèi)均存在共定位現(xiàn)象（圖3g）。

第三步，分子對接模擬驗(yàn)證二者結(jié)合位點(diǎn)

分子對接模擬構(gòu)建STAMBPL1與NRF2蛋白結(jié)合預(yù)測模型（圖3h），明確二者的潛在結(jié)合位點(diǎn)。

第四步，截短體實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證蛋白結(jié)合區(qū)域

分別構(gòu)建Flag-STAMBPL1、Myc-NRF2全長和截短體質(zhì)粒，用于293T細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)（圖3i）。

截短體Co-IP實(shí)驗(yàn)證實(shí)STAMBPL1的251–436氨基酸殘基片段可與NRF2蛋白結(jié)合，NRF2的228–605氨基酸殘基片段為結(jié)合STAMBPL1的核心區(qū)域（圖3i）。

圖3 引自Wang Z, Zhang Y, Shen Y, Zhu C, Qin X, Gao Y. Liquidambaric acid inhibits cholangiocarcinoma progression by disrupting the STAMBPL1/NRF2 positive feedback loop. Phytomedicine 136:156303(2025).

IP-MS技術(shù)路線

（1）總蛋白提?。菏占?xì)胞，用預(yù)冷的IP裂解液提取蛋白。

（2）Input樣品制備：取30 μL裂解液作為input。

（3）總蛋白與抗體孵育：實(shí)驗(yàn)組加目標(biāo)蛋白IP抗體、對照組加IgG抗體。

（4）proteinA/G磁珠與抗體結(jié)合：磁珠捕獲蛋白復(fù)合物。

（5）蛋白清洗：去除未結(jié)合蛋白。

（6）蛋白洗脫：得到“蛋白-蛋白互作復(fù)合體”。

（7）質(zhì)譜測序：質(zhì)譜鑒定IP洗脫液蛋白成份。

圖4 內(nèi)源IP-MS技術(shù)路線圖

內(nèi)源Co-IP聯(lián)合質(zhì)譜鑒定時(shí)，常出現(xiàn)抗體輕重鏈污染問題~那么我們可以通過在樣本中融合表達(dá)帶有特定標(biāo)簽的誘餌蛋白，利用標(biāo)簽納米抗體磁珠來進(jìn)行IP實(shí)驗(yàn)。該方法能徹底避免輕重鏈污染，無論是WB還是質(zhì)譜實(shí)驗(yàn)都是適用的。

輝駿生物現(xiàn)有 Flag/HA/V5/GFP/RFP 標(biāo)簽納米抗體磁珠，有需要可聯(lián)系。

圖5 外源IP-MS技術(shù)路線示意圖

輝駿生物現(xiàn)有IP-MS、pull-down MS質(zhì)譜鑒定特惠活動(dòng)~買二送一，低至 533 元！

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IP-MS蛋白質(zhì)譜鑒定常見問題解析

Q1：膠染色方法或者深淺會(huì)不會(huì)影響質(zhì)譜？

染色方法或染色程度不會(huì)影響質(zhì)譜，但染色深淺反映了蛋白含量的高低，建議不要染色過度，否則容易造成誤判；由于銀染靈敏度高，如果銀染條帶很淺，表明蛋白量較低，鑒定到的蛋白數(shù)目可能偏少。

Q2：IP/pull down類樣本跑SDS-PAGE膠質(zhì)檢后，如果判斷是否能送樣質(zhì)譜？

（1）如果SDS-PAGE條帶較少或較淺都可能導(dǎo)致鑒定蛋白偏少，可增加樣本量再檢測。

（2）若抗體輕重鏈污染嚴(yán)重，可切去對應(yīng)條帶，回收其余條帶上機(jī)質(zhì)譜。

（3）如果有明確的目標(biāo)蛋白，請先做目標(biāo)蛋白的western-blot來確定其是否存在。

（4）樣本存在未知雜質(zhì)會(huì)造成質(zhì)譜與電泳結(jié)果偏差，您可聯(lián)系我方售后技術(shù)支持解決。

Q3：Western-blot檢測到的蛋白，為什么質(zhì)譜檢測不到？

（1）Western blot 依靠特異性抗體檢測并放大目標(biāo)蛋白信號，受背景蛋白干擾??；質(zhì)譜需同步檢測多種蛋白，低豐度目標(biāo)蛋白易受高豐度蛋白影響，難以檢出。

（2）質(zhì)譜無法實(shí)現(xiàn)蛋白全覆蓋檢測，同一樣本多次上機(jī)結(jié)果也會(huì)存在差異，蛋白低表達(dá)、IP 富集不佳時(shí)檢出難度更高。

（3）常規(guī)質(zhì)譜采用胰蛋白酶（酶切位點(diǎn) K、R）酶解，蛋白序列中該位點(diǎn)數(shù)量異常會(huì)產(chǎn)生不適配肽段；小分子蛋白建議提前分析序列。

（4）檢索數(shù)據(jù)庫需包含目標(biāo)蛋白序列，如病毒侵染細(xì)胞樣本，需額外導(dǎo)入病毒蛋白序列方可完成鑒定。

輝駿生物質(zhì)譜鑒定客戶文獻(xiàn)

1. Mex-3 RNA binding family member A (MEX3A)/circMPP6 complex promotes colorectal cancer progression by inhibiting autophagy. Signal Transduction and Targeted Therapy. 2024. 1區(qū), IF=52.7.
2. The EGR1-mediated lncRNA TENM3-AS1 potentiates gastric cancer metastasis via reprogramming fatty acid metabolism. 2025. 1區(qū), IF=33.9.
3. The snoRNA-like lncRNA LNC-SNO49AB drives leukemia by activating the RNA-editing enzyme ADAR1. Cell Discovery. 2022. 1區(qū), IF=33.5.