蛋白質(zhì)相互作用（PPI）是細(xì)胞信號(hào)調(diào)控與分子機(jī)制研究的核心內(nèi)容，廣泛應(yīng)用于腫瘤、免疫及基礎(chǔ)生物學(xué)研究。科研中常因?qū)嶒?yàn)設(shè)計(jì)不規(guī)范、對(duì)照缺失、機(jī)制邏輯不完善，導(dǎo)致 PPI 實(shí)驗(yàn)重復(fù)性低、數(shù)據(jù)質(zhì)量差。

依托15年平臺(tái)實(shí)操經(jīng)驗(yàn)與高分文獻(xiàn)實(shí)驗(yàn)范式，輝駿生物整理六大標(biāo)準(zhǔn)化 PPI 研究體系，覆蓋二元互作驗(yàn)證、多蛋白互作分析、結(jié)合結(jié)構(gòu)域鑒定、甲基化 / 泛素化修飾機(jī)制研究，一站式解決六大核心科研問(wèn)題：

1.體內(nèi)外聯(lián)合驗(yàn)證雙蛋白真實(shí)物理結(jié)合

2.驗(yàn)證內(nèi)外源調(diào)控因子對(duì)蛋白互作強(qiáng)度的影響

3.同步檢測(cè)單一蛋白與兩種靶蛋白的互作模式

4.截短體實(shí)驗(yàn)定位蛋白互作關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域

5.靶蛋白甲基化修飾定量檢測(cè)與機(jī)制探究

6.靶蛋白泛素化修飾表征及功能解析

輝駿生物標(biāo)準(zhǔn)化梳理 Co-IP、GST Pull-down 分組方案、實(shí)驗(yàn)質(zhì)控與定量判讀邏輯，搭建完整閉環(huán) PPI 驗(yàn)證體系，為各科研單位提供穩(wěn)定規(guī)范的蛋白互作整套實(shí)驗(yàn)解決方案。

蛋白互作驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)方法

Co-IP實(shí)驗(yàn)
Co-IP是利用“抗原-抗體”之間免疫結(jié)合的原理，在IP實(shí)驗(yàn)過(guò)程中保持目標(biāo)蛋白同其互作蛋白的結(jié)合狀態(tài)，使目標(biāo)蛋白的互作蛋白共同被沉淀收集；

圖1 Co-IP實(shí)驗(yàn)原理圖

pull-down實(shí)驗(yàn)

pull down一般指將目標(biāo)蛋白通過(guò)GST、His等標(biāo)簽掛于樹(shù)脂/磁珠，利用“蛋白標(biāo)簽-配體”之間的親和作用原理，將帶標(biāo)簽的目標(biāo)蛋白純化出來(lái)，再與待測(cè)的樣本裂解液孵育，將裂解液中的互作蛋白調(diào)取下來(lái)。

圖2 pull-down實(shí)驗(yàn)原理圖

簡(jiǎn)單來(lái)說(shuō)，Co-IP捕獲目的蛋白及其互作蛋白，pulldown用融合標(biāo)簽的重組蛋白來(lái)捕獲其互作蛋白。具體區(qū)別如下：

蛋白互作應(yīng)用案例

1、驗(yàn)證2個(gè)蛋白存在互作

一般通過(guò)體內(nèi)Co-IP和體外Pull-down實(shí)驗(yàn)來(lái)共同驗(yàn)證2個(gè)蛋白相互作用。該研究通過(guò)體內(nèi)Co-IP聯(lián)合體外GST pull-down實(shí)驗(yàn)共同驗(yàn)證FBXO7與PRMT1的蛋白相互作用。

正拉Co-IP實(shí)驗(yàn)以IgG為陰性對(duì)照、PRMT1為實(shí)驗(yàn)組，WCL為樣本總蛋白，目的看蛋白是否表達(dá)，均顯示有條帶，表明各組目的蛋白成功表達(dá)。PRMT1抗體IP下拉產(chǎn)物中可有效富集PRMT1蛋白，同時(shí)檢測(cè)到FBXO7蛋白條帶，證實(shí)PRMT1與FBXO7存在相互作用（圖3c）。

反向Co-IP實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證二者互作，實(shí)驗(yàn)同樣設(shè)置IgG為陰性對(duì)照、FBXO7為實(shí)驗(yàn)組，采用FBXO7抗體進(jìn)行IP下拉。結(jié)果顯示，F(xiàn)BXO7抗體可下拉富集到PRMT1蛋白，說(shuō)明二者存在相互作用（圖3d）。

體外GST pull-down實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證二者的直接相互作用，實(shí)驗(yàn)以空載GST蛋白為對(duì)照、GST-FBXO7融合蛋白為實(shí)驗(yàn)組，His-MBP-PRMT1為待測(cè)互作蛋白。結(jié)果顯示，GST-FBXO7融合蛋白可有效下拉His-MBP-PRMT1蛋白，而對(duì)照組無(wú)特異性條帶，證實(shí)GST-FBXO7融合蛋白與His-MBP-PRMT1蛋白存在直接相互作用（圖3g）。

圖3 引自FBXO7 ubiquitinates PRMT1 to suppress serine synthesis and tumor growth in hepatocellular carcinoma. Nat Commun 15(1):4790(2024). 

2、研究某因素對(duì)兩個(gè)蛋白結(jié)合的影響

利用Co-IP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)某因素對(duì)2個(gè)蛋白結(jié)合量的變化。該研究通過(guò)Co-IP檢測(cè)Flag-MVP蛋白對(duì)HA-ASK1與His-TRAF6相互作用的調(diào)控效果。實(shí)驗(yàn)設(shè)置多組對(duì)照排除實(shí)驗(yàn)干擾：

①組為空白對(duì)照組，

②組僅轉(zhuǎn)染Flag-MVP質(zhì)粒，

③組僅轉(zhuǎn)染HA-ASK1質(zhì)粒，

④組僅轉(zhuǎn)染His-TRAF6質(zhì)粒（四組為IP對(duì)照組）；

⑤組共轉(zhuǎn)染HA-ASK1與His-TRAF6質(zhì)粒，

⑥組共轉(zhuǎn)染Flag-MVP、HA-ASK1與His-TRAF6三種質(zhì)粒（兩組為IP實(shí)驗(yàn)組）。

Input結(jié)果顯示，各質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組均檢測(cè)到對(duì)應(yīng)目的蛋白條帶，證實(shí)各外源蛋白均成功表達(dá)，可用于后續(xù)互作檢測(cè)。

IP實(shí)驗(yàn)采用HA抗體進(jìn)行下拉富集，⑤⑥組能富集到HA-ASK1蛋白，顯示有條帶，表明IP實(shí)驗(yàn)成功。IP實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，⑤組可通過(guò)HA-ASK1下拉富集到His-TRAF6蛋白，證實(shí)ASK1與TRAF6存在相互作用；而共轉(zhuǎn)Flag-MVP的⑥組中，His-TRAF6特異性條帶完全消失，表明Flag-MVP過(guò)表達(dá)可顯著抑制ASK1與TRAF6的蛋白相互作用。

圖4 引自L(fǎng)iu Q, Pan J, Bao L, et al. Major Vault Protein Prevents Atherosclerotic Plaque Destabilization by Suppressing Macrophage ASK1-JNK Signaling. Arterioscler Thromb Vasc Biol 42(5):580-596(2022).

3、驗(yàn)證1個(gè)蛋白與另外2個(gè)蛋白存在互作

利用CoIP同時(shí)驗(yàn)證1個(gè)蛋白與另外2個(gè)蛋白的之間的相互作用。該研究同時(shí)驗(yàn)證Pit1分別與RGA4、Pit2的蛋白相互作用。實(shí)驗(yàn)設(shè)置兩組對(duì)照體系，第①組共轉(zhuǎn)Pit1-HA質(zhì)粒與RGA4-myc質(zhì)粒，第②組共轉(zhuǎn)Pit1-HA質(zhì)粒與Pit2-myc質(zhì)粒。

Input樣本結(jié)果顯示，各組均檢測(cè)到對(duì)應(yīng)的目的蛋白條帶，證實(shí)所有外源質(zhì)粒均成功表達(dá)目的蛋白；同時(shí)實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染RGA4質(zhì)粒的樣本未檢測(cè)到Pit2蛋白條帶，轉(zhuǎn)染Pit2質(zhì)粒的樣本未檢測(cè)到RGA4蛋白條帶，二者互為陰性對(duì)照，排除了質(zhì)粒交叉表達(dá)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾。

IP實(shí)驗(yàn)采用HA抗體進(jìn)行下拉富集，各組IP產(chǎn)物中均能檢測(cè)到Pit1-HA蛋白條帶，表明IP實(shí)驗(yàn)成功。IP結(jié)果顯示，第①組樣本中未檢測(cè)到RGA4-myc特異性條帶，表明Pit1與RGA4不存在蛋白相互作用；第②組樣本可檢測(cè)到Pit2-myc特異性條帶，證實(shí)Pit1與Pit2存在相互作用。

綜上，Pit1-HA與Pit2-Myc存在相互作用，與RGA4-Myc無(wú)相互作用。

圖5 引自L(fǎng)i Y, Wang Q, Jia H, et al. An NLR paralog Pit2 generated from tandem duplication of Pit1 fine-tunes Pit1 localization and function. Nat Commun 15(1):4610(2024).

4、驗(yàn)證蛋白互作結(jié)構(gòu)域

（1）Co-IP體內(nèi)驗(yàn)證蛋白結(jié)合的結(jié)構(gòu)域

該研究通過(guò)CoIP實(shí)驗(yàn)體內(nèi)驗(yàn)證FBXO7與PRMT1的結(jié)合結(jié)構(gòu)域。實(shí)驗(yàn)以Flag-FBXO7為誘餌蛋白，GFP-PRMT1為待測(cè)蛋白，首先構(gòu)建了PRMT1的多種截短體用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)（圖6h）。實(shí)驗(yàn)設(shè)置共轉(zhuǎn)染GFP-PRMT1全長(zhǎng)與Flag-FBXO7為對(duì)照組，共轉(zhuǎn)染GFP-PRMT1不同截短體與Flag-FBXO7為實(shí)驗(yàn)組。

IP實(shí)驗(yàn)采用Flag抗體進(jìn)行下拉富集，各組IP產(chǎn)物中均能檢測(cè)到Flag-FBXO7蛋白條帶，表明IP實(shí)驗(yàn)成功。IP結(jié)果顯示，F(xiàn)lag-FBXO7可下拉富集到PRMT1全長(zhǎng)蛋白，表明FBXO7與PRMT1存在相互作用。截短體結(jié)合實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，PRMT1的1-22位氨基酸截短體無(wú)法與FBXO7結(jié)合，條帶消失，提示該片段并非二者的結(jié)合區(qū)域；而PRMT1其余兩段截短體均可與FBXO7正常結(jié)合，顯示有條帶，明確了FBXO7與PRMT1的結(jié)合功能區(qū)域。

J圖進(jìn)一步驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)Flag-FBXO7與PRMT1的23-162這一段截短體是有結(jié)合的；而缺失這一段之后，條帶消失，說(shuō)明這一段就是結(jié)合的區(qū)域。

圖6 引自FBXO7 ubiquitinates PRMT1 to suppress serine synthesis and tumor growth in hepatocellular carcinoma. Nat Commun 15(1):4790(2024).

（2）GST Pull-down體外驗(yàn)證蛋白結(jié)合的結(jié)構(gòu)域

該研究通過(guò)GST Pull-down體外驗(yàn)證USP5與PD-1的蛋白結(jié)合的結(jié)構(gòu)域。實(shí)驗(yàn)設(shè)置GST空載蛋白為對(duì)照組，以GST-USP5全長(zhǎng)蛋白及不同截短體蛋白為實(shí)驗(yàn)組。

WCL組可檢測(cè)到HA蛋白條帶，銀染結(jié)果證實(shí)各組GST空載蛋白、GST-USP5全長(zhǎng)及截短體蛋白均成功純化表達(dá)，可用于后續(xù)結(jié)合實(shí)驗(yàn)分析。

Pull-down實(shí)驗(yàn)洗脫結(jié)果顯示，GST-USP5全長(zhǎng)蛋白可有效富集PD-1-cHA蛋白，證實(shí)USP5與PD-1存在直接的體外相互作用；而缺失UBA1/2結(jié)構(gòu)域的USP5截短體無(wú)法富集PD-1-cHA蛋白，結(jié)合條帶完全消失，表明USP5的UBA1/2結(jié)構(gòu)域是其與PD-1蛋白結(jié)合的核心區(qū)域。

圖7 引自Xiao X, Shi J, He C, et al. ERK and USP5 govern PD-1 homeostasis via deubiquitination to modulate tumor immunotherapy. Nat Commun 14(1):2859(2023).

5、驗(yàn)證蛋白甲基化修飾水平

該研究通過(guò)Co-IP檢測(cè)FBXO7對(duì)內(nèi)源PHGDH甲基化修飾水平的調(diào)控作用。實(shí)驗(yàn)設(shè)置shScramble作為陰性對(duì)照組，兩種FBXO7敲除細(xì)胞系作為實(shí)驗(yàn)組。

WCL樣本結(jié)果顯示，各組目的蛋白均有蛋白條帶，證明樣本中蛋白表達(dá)正常；且相較于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組FBXO7蛋白條帶顯著減弱，證實(shí)FBXO7敲除細(xì)胞系構(gòu)建成功，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)分析。

IP實(shí)驗(yàn)利用PHGDH抗體進(jìn)行下拉富集，結(jié)果顯示，相較于對(duì)照組，F(xiàn)BXO7敲除細(xì)胞系中PHGDH甲基化位點(diǎn)條帶顯著加深，表明敲除FBXO7可顯著促進(jìn)PHGDH的甲基化修飾水平。同時(shí)，各組PHGDH總蛋白條帶無(wú)明顯差異，提示敲除FBXO7不影響PHGDH的本底表達(dá)水平。

圖7 引自FBXO7 ubiquitinates PRMT1 to suppress serine synthesis and tumor growth in hepatocellular carcinoma. Nat Commun 15(1):4790(2024).

6、驗(yàn)證蛋白泛素化修飾水平

該研究通過(guò)Co-IP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)FBXO7對(duì)外源表達(dá)PRMT1蛋白泛素化修飾水平的影響。實(shí)驗(yàn)以GFP-PRMT1為待測(cè)蛋白、Flag-FBXO7（野生型及突變型）為誘餌蛋白，同時(shí)引入帶HA標(biāo)簽的泛素蛋白（HA-Ub）用于指示蛋白泛素化修飾水平。對(duì)照組共轉(zhuǎn)染Flag空載、HA-Ub與GFP-PRMT1質(zhì)粒，實(shí)驗(yàn)組分別共轉(zhuǎn)染Flag-FBXO7野生型/突變型、HA-Ub與GFP-PRMT1質(zhì)粒。

IP實(shí)驗(yàn)通過(guò)GFP抗體下拉富集GFP標(biāo)記的PRMT1蛋白，檢測(cè)其泛素化修飾水平變化。IP結(jié)果顯示，第2個(gè)泳道可檢測(cè)到明顯的HA條帶，證實(shí)PRMT1蛋白本身存在基礎(chǔ)水平的泛素化修飾；第3個(gè)泳道過(guò)表達(dá)野生型Flag-FBXO7后，HA條帶顯著加深，表明FBXO7可顯著促進(jìn)GFP-PRMT1的泛素化修飾水平。而第4個(gè)泳道轉(zhuǎn)染Flag-FBXO7突變體后，HA條帶無(wú)明顯變化，進(jìn)一步證實(shí)野生型FBXO7可特異性介導(dǎo)并促進(jìn)PRMT1蛋白的泛素化修飾，突變型FBXO7則喪失該調(diào)控功能。

圖8 引自FBXO7 ubiquitinates PRMT1 to suppress serine synthesis and tumor growth in hepatocellular carcinoma. Nat Commun 15(1):4790(2024).

Co-IP、pull-down實(shí)驗(yàn)常見(jiàn)問(wèn)題

1、Co-IP/Pull-down實(shí)驗(yàn)無(wú)互作條帶、靶蛋白拉不下來(lái)是什么原因？

首先排查蛋白互作本身，部分蛋白互作屬于弱瞬時(shí)互作，常規(guī)實(shí)驗(yàn)條件難以捕獲。其次大概率是實(shí)驗(yàn)體系問(wèn)題，裂解液若使用SDS等強(qiáng)變性去污劑，會(huì)直接破壞蛋白天然結(jié)合結(jié)構(gòu)，徹底打斷蛋白互作。

同時(shí)抗體選擇不當(dāng)、孵育時(shí)間過(guò)短、磁珠/瓊脂糖珠用量不足，也會(huì)導(dǎo)致誘餌蛋白富集量低，無(wú)法抓取靶蛋白。另外，蛋白降解、樣本反復(fù)凍融，會(huì)造成誘餌蛋白流失，最終出現(xiàn)無(wú)條帶的情況。優(yōu)化核心是選用NP-40等溫和非變性裂解液，使用IP級(jí)抗體，充足孵育并優(yōu)化磁珠用量。

2、Co-IP/Pull-down實(shí)驗(yàn)條帶雜帶多、背景極高如何解決？

高背景是該類(lèi)實(shí)驗(yàn)最常見(jiàn)問(wèn)題，核心原因是非特異性吸附過(guò)多。一是磁珠/樹(shù)脂本身會(huì)非特異性結(jié)合雜蛋白；二是洗滌條件過(guò)于溫和，洗滌次數(shù)少、洗滌液鹽濃度和去污劑濃度過(guò)低，無(wú)法清洗雜蛋白；三是樣本中存在未裂解完全的蛋白復(fù)合物、細(xì)胞碎片殘留。

常用解決方案是實(shí)驗(yàn)前用空白珠子對(duì)樣本進(jìn)行預(yù)清除，增加洗滌次數(shù)、梯度提升洗滌液嚴(yán)謹(jǐn)度，同時(shí)樣本裂解后短暫超聲、高速離心取上清，去除雜質(zhì)干擾。

3、Co-IP實(shí)驗(yàn)出現(xiàn)嚴(yán)重的抗體輕重鏈污染怎么辦？

進(jìn)行IP洗脫步驟的時(shí)候，誘餌蛋白、互作蛋白洗脫下來(lái)同時(shí)， 四聚體形式的IP抗體也會(huì)被一同洗脫下來(lái)，WB檢測(cè)時(shí)會(huì)出現(xiàn)明顯重鏈和輕鏈條帶，嚴(yán)重干擾靶蛋白條帶判讀，尤其會(huì)影響后續(xù)質(zhì)譜鑒定結(jié)果。

圖9 IP抗體輕重鏈?zhǔn)疽鈭D

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