DNA與蛋白質的特異性結合，是基因轉錄、損傷修復、細胞穩(wěn)態(tài)調控的核心分子基礎。精準篩選并驗證DNA結合蛋白，是解析基因調控機制、產(chǎn)出高水平科研成果的關鍵。

在轉錄調控、啟動子功能研究中，DNA結合蛋白篩選是核心難點。傳統(tǒng)實驗易出現(xiàn)非特異性結合、重復性差、數(shù)據(jù)可信度低等問題，嚴重制約課題推進與論文發(fā)表。目前高分SCI研究普遍采用“篩選—驗證—確證”閉環(huán)體系，結合DNA pull-down質譜初篩與ChIP體內外驗證，可嚴謹驗證DNA-蛋白特異性互作，是領域主流標準化研究范式。

輝駿生物深耕分子互作研究15年，依托標準化實驗平臺與高分文獻研究經(jīng)驗，梳理優(yōu)化DNA pull-down、ChIP核心實驗流程與分析方法，提供一站式互作實驗解決方案，高效攻克實驗難題，助力科研人員發(fā)表高質量學術成果。

目標DNA與蛋白互作驗證方法

1、DNA pull-down實驗

DNA pull down是研究目標DNA與蛋白質相互作用的技術。通過在體外條件下制備生物素標記的目標DNA探針，來調取樣本中與之結合的蛋白質，可以通過質譜篩選未知結合蛋白，或通過WB驗證預測的已知蛋白。

圖1 DNA pull-down實驗原理圖

DNA pulldown實驗操作步驟關鍵點主要分為以下七步：

2、ChIP實驗

ChIP是研究目標蛋白質與DNA相互作用的技術。利用誘餌蛋白抗體來調取生物體內天然結合的誘餌蛋白及其結合DNA片段的復合體，進而通過測序尋找未知的結合DNA序列，或通過qPCR驗證預測的已知DNA序列。

圖2 ChIP實驗原理圖-輝駿生物

ChIP實驗操作步驟關鍵點主要分為以下九步：

DNA pull-down和ChIP實驗都是驗證DNA與蛋白質相互作用的核心手段，那么到底什么時候用DNA pull-down？什么時候用ChIP呢？

簡單來說：DNA pull-down是體外驗證，以目標DNA為核心，驗證它能否與待測蛋白發(fā)生特異性結合；ChIP是體內驗證，以目標蛋白為切入點，反向驗證其是否結合待測DNA序列。兩大實驗各司其職、互為補充，也是高分文章中互作驗證雙向佐證的關鍵！具體核心區(qū)別整理如下：

DNA與蛋白互作文獻應用案例

1、DNA pull-down MS篩選BmPOUM2 G4的互作蛋白是BmLARK

DNA pull-down MS實驗篩選BmPOUM2 G4結構的結合核蛋白，成功初步篩選獲得候選互作核蛋白（圖3Aa，由輝駿生物提供技術）。

DNA pull-down WB實驗證實BmLARK與BmPOUM2 G4結構存在相互作用，含G4結構的特異性DNA探針可成功下拉BmLARK蛋白，而無G4結構的突變探針組及樣品裂解液對照組均無BmLARK蛋白信號（圖3Ab）。

EMSA實驗進一步證實BmLARK蛋白能夠特異性結合BmPOUM2的G4序列（圖3B）。

該研究通過DNA pull-down MS篩選、DNA pull-down WB及EMSA驗證實驗，成功篩選出BmPOUM2 G4結構的特異性結合核蛋白，并證實BmLARK與BmPOUM2 G4結構存在特異性相互作用。

圖3 引自[輝駿生物客戶文章] Niu K, Xiang L, Jin Y, et al. Identification of LARK as a novel and conserved G-quadruplex binding protein in invertebrates and vertebrates. Nucleic Acids Res 47(14):7306-7320(2019). 

2、DNA pull-down MS篩選Smad3的互作蛋白是H-Ras

DNA pull-down MS篩選Smad3的潛在互作蛋白，分析鑒定出H-Ras、Vinculin、Talin-1、CASK及Carmil2潛在互作蛋白（圖4L、4M，由輝駿生物提供技術）。

STRING數(shù)據(jù)庫預測分析證實，眾多候選蛋白中僅H-Ras可與Smad3發(fā)生相互作用（圖4N）。

Co-IP實驗進一步證實Smad3與H-Ras存在相互作用（圖4P）。

該研究通過DNA pull-down MS篩選、STRING數(shù)據(jù)庫預測及Co-IP驗證實驗，成功篩選并證實Smad3與H-Ras存在相互作用，明確了調控PRDM16轉錄的Smad3關鍵互作分子。

圖4 引自[輝駿生物客戶文章] Yuan Q, Tang B, Zhu Y, et al. PRDM16 acts as a therapeutic downstream target of TGF-β signaling in chronic kidney disease. JCI Insight 10(17):e191458(2025). 

3、DNA pull-down MS篩選CLC-3的互作蛋白是XRCC5

DNA pull-down MS實驗篩選鑒定出XRCC5為CLC-3啟動子的候選結合蛋白（圖5a-b）。

DNA pull-down WB實驗進一步證實XRCC5蛋白可與CLC-3啟動子發(fā)生相互作用（圖5c）。

ChIP實驗驗證結果顯示，XRCC5與CLC-3 DNA在多種細胞中均存在相互作用，且二者結合水平在正常細胞中最低（圖5d）。

該研究通過DNA pull-down MS篩選、DNA pull-down WB及ChIP實驗，成功篩選并驗證出CLC-3啟動子的核心結合分子XRCC5，證實二者存在穩(wěn)定的相互作用，并明確了不同細胞中二者的結合差異特征。

圖5 引自Gu Z, Li Y, Yang X, et al. Overexpression of CLC-3 is regulated by XRCC5 and is a poor prognostic biomarker for gastric cancer. J Hematol Oncol 11(1):115(2018).

DNA pull down、ChIP結果解讀

1、DNA pull down實驗結果解讀

為明確CLC-3啟動子是否與PARP1蛋白存在相互作用，研究者利用CLC-3啟動子探針及陰性對照NSP，從GC細胞中富集提取核蛋白-DNA復合物，DNA pull-down WB實驗證實CLC-3啟動子與PARP1蛋白存在相互作用（圖6）。

圖6 引自Gu Z, Li Y, Yang X, et al. Overexpression of CLC-3 is regulated by XRCC5 and is a poor prognostic biomarker for gastric cancer. J Hematol Oncol 11(1):115(2018).

2、ChIP實驗結果解讀

為驗證YY1蛋白是否與TRIM34啟動子區(qū)域存在相互作用，研究者通過ChIP實驗進行驗證，證實YY1蛋白可與TRIM34啟動子區(qū)域發(fā)生特異性結合（圖7）。

圖7 引自Yao F, Zhou S, Zhang R, et al. CRISPR/Cas9 screen reveals that targeting TRIM34 enhances ferroptosis sensitivity and augments immunotherapy efficacy in hepatocellular carcinoma. Cancer Lett 593:216935(2024). 

DNA pull-down和ChIP實驗常見問題

1、做DNA pull-down實驗時蛋白質可能與非特定的DNA序列結合，導致背景信號增加？

嘗試優(yōu)化DNA探針的設計，選擇更特異的DNA序列作為探針，以增加結合的特異性。還可以通過引入競爭性DNA或非特異性DNA序列來減少非特異性結合。

2、DNA pull-down實驗是否一定要提核蛋白做？

DNA pull-down實驗是否一定要提核蛋白做？最好提取核蛋白，但如果碰到動植物組織等樣本核蛋白提取比較難或提取效率低的情況，可以直接提總蛋白做。因為高靈敏度的質譜儀可以保證低豐度的核蛋白不漏檢，而生信分析也可以幫助尋找數(shù)據(jù)中的核蛋白和轉錄因子。

輝駿生物深耕蛋白檢測領域十余年，依托自有質譜平臺，可提供高效、精準的質譜檢測與數(shù)據(jù)分析服務，覆蓋各類分子互作實驗，一站式助力科研課題推進與高分論文發(fā)表。

3、所研究的蛋白難以找到ChIP級抗體怎么辦？

較常用的方式可以將目的蛋白同某種標簽融合表達，比如HA、GFP、Flag等標簽，使用這些標簽抗體的ChIP級抗體，這種途徑也常見于發(fā)表文獻中。

輝駿生物 Flag/HA/GFP/RFP這4款類型的標簽ChIP試劑盒，有需要可聯(lián)系：4006991663。

4、ChIP超聲破碎DNA時產(chǎn)生氣泡，對破碎效果有影響嗎？

接觸式的超聲儀會產(chǎn)生氣泡，需要把功率調小一些，否則氣泡會影響DNA破碎效果。

5、ChIP實驗為什么沒有任何富集？

確保使用ChIP級別驗證的抗體，并按照說明書選擇實驗的抗體量。還建議使用ChIP驗證的陽性和陰性對照（包括在試劑盒中）來驗證ChIP分析的效率。高質量的染色質樣品和染色質片段大小在150 - 900 bp之間也很重要。

輝駿生物實驗服務優(yōu)勢

輝駿生物15年深耕分子互作領域，可提供DNA-蛋白、蛋白-蛋白、RNA-蛋白互作一站式實驗方案。依托自有質譜平臺，專業(yè)開展pull-down、IP質譜檢測與數(shù)據(jù)分析，全程技術跟進，已助力多篇高分SCI成果發(fā)表。

輝駿生物DNA pull-down試劑盒、ChIP試劑盒

輝駿生物簡介

廣州輝駿生物科技股份有限公司（Fitgene）成立于2011年，總部位于廣東廣州。公司擁有超15年科研服務經(jīng)驗，專業(yè)提供蛋白（抗體）和互作實驗服務，包括蛋白質譜檢測、蛋白/RNA/DNA/化合物等分子間相互作用檢測、抗體穩(wěn)定表達株構建、基因敲除和過表達細胞株構建等；同時還研發(fā)了納米抗體磁珠、IP專用二抗、互作試劑盒、標簽抗體等科研產(chǎn)品。

公司自有分子、細胞和蛋白等實驗平臺，服務經(jīng)驗豐富，保證結果真實、可靠！我們不僅會提供專業(yè)的售前方案建議、而且售后技術支持將一直保持到文章發(fā)表，確保您安心進行下游實驗及投稿。

目前，客戶已在Signal Transduction and Targeted Therapy (IF: 52.7）、Journal of Hematology & Oncology (IF: 40.4)、European Heart Journal (IF: 35.7）、Molecular Cancer (IF: 33.9）、Cell Discovery (IF: 33.5）、Nature Methods (IF: 32.1）等高水平期刊成功發(fā)表大量高分文章。