免疫共沉淀（Co-IP）是體內驗證蛋白互作的經(jīng)典技術，內源 Co-IP 廣泛應用于細胞、腫瘤方向機制研究。實驗原理簡潔，借助磁珠或瓊脂糖樹脂偶聯(lián)抗體捕獲靶蛋白，富集結合的互作蛋白。

實操階段常常遇到無條帶、雜帶嚴重等難題，另外 IP 條帶深淺與互作強度關系、正反拉結果不一致如何判定，也是科研工作者常見疑問。大量盲目重復實驗，造成試劑與樣本浪費。

輝駿生物結合多年項目實操經(jīng)驗，系統(tǒng)梳理內源 Co-IP 完整實驗方案，涵蓋原理、操作規(guī)范、條帶判讀與實驗避坑要點，助力高效開展蛋白互作驗證研究。

內源Co-IP實驗基本概述

1、實驗原理

樣本裂解后，孵育誘餌蛋白抗體，抗體捕獲樣本中的誘餌蛋白，再與protein A/G beads孵育，將“抗體-誘餌蛋白-互作蛋白”一起“共沉淀”到Beads上。洗掉未結合的蛋白后，再將“誘餌蛋白-互作蛋白”從Beads上洗脫下來，得到Co-IP洗脫液，該洗脫液既可用于Western Blot檢測（驗證已知結合蛋白），也可用于質譜鑒定（篩選未知結合蛋白）。

圖1 內源蛋白Co-IP原理圖

當誘餌蛋白IP抗體不好用或者內源表達量低時，可以在樣本中融合表達帶有特定標簽的誘餌蛋白，利用標簽抗體做免疫沉淀，也就是標簽蛋白Co-IP。

2、主要優(yōu)缺點

優(yōu)點：

①無需載體構建；

②能最真實地反映生理狀態(tài)下的蛋白行為；

③互作信息可信度高。

缺點：

①當目標蛋白豐度低的話，可能會IP不成功；

②對抗體特異性和親和力的要求極高，需要IP級別的目的蛋白抗體，成本高；

③而且容易出現(xiàn)抗體輕重鏈污染，比如目標蛋白剛好在55kD和25kD，抗體條帶可能掩蓋目標蛋白條帶，導致結果不好判斷。

內源Co-IP詳細操作步驟

1、總蛋白提取

1.1 動物細胞樣本

（1）培養(yǎng)目標細胞，待細胞生長至合適密度，收集細胞；

（2）用預冷PBS緩沖液清洗細胞2-3次，加入300-500 μL預冷的IP裂解緩沖液（輝駿貨號為：FI8101），在IP裂解液中預先加入3-5 μL蛋白酶抑制（輝駿貨號為：FI8105），現(xiàn)用現(xiàn)配；

（3）4℃混勻儀上裂解30 min；為了更充分裂解，最好冰上超聲至溶液基本澄清（如果無超聲條件，可置于冰上裂解30 min，期間每10 min渦旋混勻一次，每次5 s）；

（4）4℃離心機12000 rpm離心15min，收集上清至新的1.5 mL EP管中。

注意：保證加入足量的蛋白酶抑制劑，實驗需全程在冰上操作，避免蛋白出現(xiàn)降解。

1.2 動物組織樣本

用預冷的PBS清洗新鮮組織，去除血液等成分；實驗組和對照組分別取0.1-0.2 g干凈的組織，用液氮在研缽中充分研磨，隨后轉移至預冷的新離心管中。后續(xù)步驟與處理細胞時相似（超聲破碎時間可稍長，但一般不超過5min）。

2、Input 樣品制備與檢測

每組取30 μL蛋白，加1×SDS-PAGE上樣緩沖液混勻，95℃加熱5-10 min；WB驗證目標蛋白表達。

圖2 WB檢測input樣本蛋白表達情況

3、總蛋白與抗體孵育

蛋白樣本分兩組，實驗組加IP級目標蛋白抗體，對照組加同源同型Normal IgG（分組如下圖所示）；每組加入相應的抗體之后，置于混勻儀4℃孵育4h或過夜。

圖3 內源Co-IP實驗分組設計

4、Protein A/G 磁珠與抗體結合

向磁珠中加入蛋白樣本/抗體復合物，充分混勻，置于4℃混勻儀上孵育3-4 h。（注意：視頻里面展示的是磁珠與抗體先孵育，再與蛋白樣本進行共孵育。這兩種步驟呢都是可以的~）

對于內源性IP實驗，磁珠要選擇結合效率高的，可以減少非特異結合，推薦輝駿生物proteinA/G磁珠（輝駿貨號：FI8302），親測IP結果超好，條帶又亮又干凈！

5、清洗磁珠

孵育結束后，放磁力架上靜置1 min，棄上清，加入500 μL漂洗緩沖液，顛倒混勻30次；放磁力架上靜置1 min，棄上清，重復上述洗滌步驟2次。

6、蛋白洗脫

6.1 變性洗脫

加50 μL 1×SDS-PAGE上樣緩沖液，振蕩瞬離后95℃加熱5-10 min；磁力架靜置1 min，收集上清用于檢測或切膠質譜。

6.2 非變性洗脫

向磁珠中加入40-50 μL洗脫緩沖液（輝駿貨號為：FI8102），放混勻儀上室溫洗脫10-15 min，隨后振蕩瞬離后磁力架靜置1 min，收集上清用于檢測或切膠質譜。

注意：非變性洗脫法可以保持蛋白的活性，變性洗脫法的洗脫效率更高，但抗體輕重鏈的污染也更嚴重。

如果只是WB時IgG的輕重鏈太深不好看，其實可以不管，不會影響什么。但是如果剛好在誘餌蛋白或者互作蛋白位置，影響結果判斷了，有三個方法：一個是選擇IP專用的二抗；一個是跟IP抗體不同種屬的一抗；還有一個是在樣本中過表達帶標簽的目標蛋白，用標簽納米抗體磁珠進行IP。

輝駿生物現(xiàn)有IP專用二抗、Flag/HA/V5/GFP/RFP這5款類型的標簽納米抗體磁珠，可有效避免抗體輕重鏈污染，有需要的小伙伴可以聯(lián)系！

7、蛋白檢測

?WB用Anti-Flag和Anti-Prey檢測靶蛋白互作；

?或者LC-MS/MS鑒定SDS-PAGE膠中的未知互作蛋白。

圖4 CoIP-MS技術流程

輝駿生物自有質譜檢測平臺，擅長IP、pull-down產(chǎn)物等微量蛋白的質譜鑒定及生信分析。

內源Co-IP實驗注意事項

1??抗體選擇（重中之重）：優(yōu)先選說明書明確標注「可用于IP實驗」的內源性抗體，特異性更強、結果更穩(wěn)； 

2??磁珠選擇（決定實驗成?。簝?yōu)先選結合效率高、非特異結合少的蛋白A/G磁珠，輝駿生物proteinA/G磁珠（貨號FI8302），好用到反復回購，IP結果清晰、背景干凈，省去后續(xù)很多麻煩； 

3??樣本處理：全程冰上操作，裂解液務必新鮮加蛋白酶抑制劑+磷酸酶抑制劑； 

4??抗體-磁珠孵育：先將抗體與磁珠孵育結合，再加入樣本裂解液孵育（孵育時間需要根據(jù)你目的蛋白的表達水平或者是抗親和力來進行確定）； 

5??洗滌步驟：至少洗滌3次，去除未結合的雜蛋白，減少背景干擾，但注意不要過度洗滌，避免目標蛋白流失。

內源Co-IP結果解讀

Input組：利用Anti-Bait、Anti-Prey對樣本裂解液進行WB檢測，驗證Input中是否存在Bait、Prey，從而確定蛋白的表達情況以及抗體效果；

IgG組(陰性對照組)：排除非特異性結合的干擾，normal IgG不能富集Bait，一般不會有Bait條帶，如果有條帶說明Bait與beads或IgG有非特異性結合，需要重新完善下方法；

IP組(實驗組)：Anti-Bait可以特異性富集Bait，所以一定會有Bait條帶，沒有條帶說明IP實驗失敗，需要復核IP流程，或檢查Anti-Bait是否可以用于IP實驗；如果IP洗脫液中也能檢測到Prey，說明Bait和Prey存在相互作用。

圖5 內源性蛋白Co-IP實驗結果解析圖

內源性Co-IP實驗驗證兩個已知蛋白（Bait和Prey）是否存在相互作用，如果最終的結果均有條帶，則可以證明兩個蛋白之間存在相互關系，上圖為IP陽性結果示意圖：表明Bait可以與Prey結合，存在相互作用。

文獻解讀1：

作者通過在Hepa1-6細胞中進行免疫共沉淀實驗以驗證PRMT3和HSP60是否存在相互作用，正反拉Co-IP結果證實內源HSP60與PRMT3發(fā)生相互結合（圖6）。

這一結果明確了內源水平下HSP60與PRMT3的蛋白結合關系，為解析二者協(xié)同調控細胞生理過程的分子機制提供了關鍵實驗依據(jù)，為后續(xù)相關功能機制研究奠定了重要基礎。

圖6 Co-IP驗證PRMT3與HSP60蛋白互作

文獻解讀2：

為確定FBXO7是否作為E3連接酶介導PRMT1的降解，作者檢測了二者之間的物理相互作用。Co-IP分析進一步證實了在人Huh7和PLC/PRF/5肝癌細胞中，內源性FBXO7與PRMT1的結合（圖7）。

該結果明確了FBXO7與PRMT1的蛋白結合特性，為證實FBXO7作為E3連接酶調控PRMT1蛋白降解的分子機制提供了直接的實驗證據(jù)，也為后續(xù)深入闡釋二者在肝癌細胞中的功能調控機制奠定了實驗基礎。

圖7 Co-IP驗證PRMT1與FBXO7蛋白互作

Co-IP常見問題解析

Q1：磁珠可以反復使用嗎？

不可以，洗脫的過程可能會造成磁珠表面的抗體不可逆流失或者失活，結合效率不能保證。

Q2：protein A/G磁珠和抗體結合后，在煮樣洗脫時，抗體會掉下來嗎？會有抗體輕重鏈污染嗎？

protein A/G磁珠是和抗體的Fc段非共價結合的，所以變性洗脫就會掉落產(chǎn)生抗體輕重鏈污染。

Q3：Input會不會出現(xiàn)輕重鏈？

Input是未經(jīng)處理的初始樣本裂解液，沒有加入外源性抗體（或者抗體磁珠）孵育，所以是不會有輕重鏈污染的。

Q4：IP條帶越深，結合越強嗎?

IP條帶深淺除了跟結合強弱有關，也受IP效率影響，因此不同抗體或不同批次的IP實驗不能依靠條帶深淺來判斷結合強弱。

如果您要做定量IP實驗，需要確保組別間有相同的上樣量（借助內參來確定）、相同的抗體及用量，相同的實驗條件，再根據(jù)IP條帶的深淺來判斷結合的強弱。

Q5：正拉Co-IP可以拉下條帶，而反拉驗證結果沒有，這是什么原因呢？

Co-IP的A拉B和B拉A驗證，效率和條件本身就不同。A的抗體質量好、捕獲效率高，就能拉到B；B的抗體親和力低或者表位被遮擋，反向Co-IP就可能拉不到。這種情況就需要優(yōu)化抗體和裂解條件，或借助其他方法來進一步判斷，而不是直接否定蛋白互作。

Q6：IgG抗體有什么注意的嗎？是跟目標一抗相同來源（鼠源或者兔源）的嗎？

是的，跟目標一抗相同來源。

Q7：實驗組是si可以做IP嗎？

有難度，本來ip就是要調誘餌蛋白，如果這個蛋白表達量又很低，很可能調取不到，一般不建議這樣做。

Q8：IP結果有抗體輕重鏈污染怎么辦？

如果是內源IP，可以選擇IP專用二抗來減輕抗體污染。

如果是標簽IP，可以選擇標簽（Flag/HA/V5/GFP/RFP）納米抗體磁珠來完全避免抗體污染。

有以上產(chǎn)品需求的小伙伴可以聯(lián)系輝駿生物~

Q9：input組有條帶且檢測效果很好，IP組無條帶

（1）可能原因：抗體不適合做IP或用量不足。

?解決方法：①優(yōu)先選擇標注“CoIP驗證”的抗體；②增加IP抗體或樣本的使用量

（2）可能原因：抗體與beads的結合效果差。

?解決方法：①增加孵育時間；②檢查磁珠質量，避免磁珠過期或干燥使磁珠失活。

（3）洗脫步驟不充分，目標蛋白未完全從beads上洗脫。

?解決方法：①直接將beads煮沸上樣（減少洗脫損失）；②如果必須用非變性洗脫法，可以延長洗脫時間至15 min。

Q10：input組無條帶，IP組有條帶

（1）可能原因：樣本蛋白濃度低或上樣量少。

?解決方法：增加input組的蛋白上樣量。

（2）可能原因：保存不當，導致樣本降解。

?解決方法：①全程冰上操作；②樣本裂解液中加入足量蛋白酶抑制劑, ③避免樣本反復凍融。 

（3）可能原因：IP組出現(xiàn)了假陽性結果。

?解決方法：進行質譜檢測或更換其他抗體確認。

Q11：Co-IP實驗中目的蛋白上方出現(xiàn)多條條帶，這是什么原因呢？

Co-IP中目的蛋白上方的出現(xiàn)多條條帶，說明結合了多個蛋白，這可能是泛素化、磷酸化等翻譯后修飾的產(chǎn)物，也可能是非特異性結合。要區(qū)分它們，需要用不同的檢測抗體做復染，或者用質譜確認。

輝駿生物可提供專業(yè)蛋白質譜鑒定服務，快速鑒定互作蛋白、識別蛋白翻譯后修飾，支撐蛋白互作相關課題研究

輝駿生物簡介

廣州輝駿生物科技股份有限公司（Fitgene）創(chuàng)立于 2011 年，擁有十余年科研服務經(jīng)驗。專注蛋白與分子互作相關實驗服務：蛋白質譜檢測、蛋白 / RNA/DNA/ 化合物互作驗證、穩(wěn)定細胞株構建、基因編輯細胞模型構建；自主研發(fā)納米抗體磁珠、標簽抗體、互作試劑盒等科研試劑。

公司自建分子、細胞、蛋白完整實驗平臺，實驗數(shù)據(jù)真實可靠。提供專業(yè)售前方案設計，持續(xù)跟進售后技術支持直至文章發(fā)表。眾多合作客戶已在Molecular Cancer、Nature Methods等高分期刊發(fā)表 IF＞30 研究成果。